21 Aug 2018

online-Keimkontrolle in Trink- und Prozesswasser

Klassische Kulturverfahren zur Bestimmung der Verkeimung sind für das Steuern technischer Anlagen ungeeignet, weil zu zeitaufwendig

21 Aug 2018

Nicht zuletzt durch das In-Kraft-Treten der 42. BImSchV im August 2017 werden verstärkt Verfahren und Methoden gesucht und nachgefragt, um Mikroorganismen im Wasser schneller als mit den bisher üblichen Kulturverfahren, am besten sogar online, zu bestimmen.

Für die Betreiber von offenen Rückkühlwerken und Nass-Luftwäschern schreibt die 42. BImSchV im Wesentlichen 2 mikrobiologische Untersuchungen vor: 14-tägig ist die Gesamtkeimzahl (GKZ) zu bestimmen, alle 3 Monate ist ein Legionellentest bei einem dafür zugelassenen Wasser- / Umweltlabor durchzuführen. Bei der Überschreitung vorgegebener Grenzwerte muss der Betreiber unverzüglich Schritte und Maßnahmen einleiten, um einem ungezügelten Wachstum von Mikroorganismen entgegen zu wirken und damit die Gesundheitsgefahr für die eigenen Mitarbeiter, aber auch für Passanten, die ggf. bakteriell Aerosole beim Vorbeigehen einatmen könnten, zu vermeiden.

Kulturverfahren zur Keimbestimmung für Anlagenbetrieb zu langwierig

Doch was heißt schon „unverzüglich“? – die GKZ lässt sich mittels gängiger Schnelltests („Dip-Slide-Test“) noch „rel. schnell“ bestimmen (ca. 36 Stunden); auch in dieser Zeit kommt es in einem Kühlwasserkreislauf bereits zu einem merklichen Keimwachstum, denn viele Bakterien haben Vermehrungs- / Verdopplungszyklen im Bereich weniger Stunden. Richtig problematisch wird es dann aber, wenn man beim klassischen Kulturverfahren fast 14 Tage auf das Ergebnis eines Legionellentests warten muss.

Agar-Nährboden

Foto: pixabay / CC0

Auch in der Analyse von Grundwasser-Reservoire und -Ressourcen sieht man die heute gängigen Nachweismethoden für Mikroorganismen in Wasserkörpern als unzureichend an. Im Projekt Aquascreen wird jetzt mit Förderung des Landes Niederösterreich an der KL Krems nach neuen Methoden gesucht, denn …

„Bestehende Standardmethoden zum Nachweis von Mikroorganismen in Grund- und Quellwasser gehen noch auf Nachweisprinzipien aus dem 19. Jahrhundert zurück. Diese zielen hauptsächlich auf Bakterien ab, die eine Verschmutzung des Wassers von der Oberfläche her anzeigen, nicht aber auf die wassereigenen – zum Teil sogar gänzlich unbekannten – Bakterien. In der Regel können weniger als 1 % der wassereigenen Bakterien mit den Standardverfahren nachgewiesen werden. So wissen wir bis heute wenig über die Entwicklung dieser natürlichen Wassermikrobiota und wie sich diese über längere Zeiträume bei Lagerung und Verteilung auf die Qualität von Wasser auswirken kann. Zur Einschätzung und Vorhersage der Qualität von Trinkwasser, aber auch zur Identifizierung möglicher Gesundheitsgefährdungen, ist ein besseres Verständnis dieser Dynamiken unter Berücksichtigung der vorhandenen Nährstoff- und Umgebungssituation notwendig.“ (Prof. Andreas Farnleitner, Leiter des Fachbereichs Wasserqualität und Gesundheit an der KL Krems)

Legipid-Schnelltest erlaubt quantitative Legionellenbestimmung innerhalb 1 Stunde

Neue Methoden und Verfahren zur Keimbestimmung und -kontrolle sind daher gefragt. In einem früheren Beitrag wurde bereits über einen Schnelltest berichtet, mit dem es immerhin in einer Stunde möglich ist, Legionellen im Trinkwasser sicher quantitativ nachzuweisen („Legipid-Schnelltest“). Dieser Legipid-Schnelltest ist inzwischen vielfach erprobt (z.B. bei großen Reedereien wie der Carnival Cruise Line) und bietet auch einem Betreiber offener Kühlkreisläufe ein gutes,

Legionellentest m. Primelab 1.0

Legionellentest m. Primelab 1.0,
Foto: m. freundl. Genehm. v. Pool i.d.

schnelles und preiswertes Monitoring-Instrument, um frühzeitig Maßnahmen zur Reduzierung des Keimwachstums ergreifen zu können. Damit könnten große Mengen an Bioziden, die zur Zeit häufig noch prophylaktisch zudosiert werden, eingespart werden, denn man muss nur handeln, wenn die Keimzahl außer Kontrolle gerät. Für den Betreiber eines Kühlwasserkreislaufs ein wichtiges wirtschaftliches Argument, für unsere Umwelt ein positives Signal zur Reduzierung umweltbelastender und aus den Wasserkörpern schwer zu entfernender Chemikalien.

Durchfluss-Zytometrie wird wiederbelebt

Einen anderen Weg der schnellen Keimbestimmung gehen die neuen Verfahren mit einer Wiederbelebung bzw. Verbesserung der Durchfluss-Zytometrie, einem Verfahren das bereits seit vielen Jahren bekannt ist. Dieses Verfahren erlaubt die Analyse von Einzellern, die mit rel. hoher Geschwindigkeit einzeln an einer elektrischen Spannung oder einem Lichtstrahl vorbeifließen. Je nach Form, Struktur und / oder Färbung der Zellen werden unterschiedliche Effekte erzeugt, aus denen die Eigenschaften der Mikroorganismen / Einzeller abgeleitet werden können. Zusätzlich lässt sich dieses Verfahren noch mit fluoreszenzspezifischen Markierungen kombinieren, was eine erweiterte Detektion ermöglicht.

Durchfluss-Zytometrie, Beispiele

Foto: Wikipedia / publ. domain, CC 2.5

Ein solches modernes Durchflusszytometer ist mittlerweile kommerziell verfügbar und erlaubt die kontinuierliche Keimkontrolle, z.B. der mikrobiologischen Trinkwasserqualität – allerdings nicht vollständig quantitativ , sondern nur teil-quantitativ: Änderungen der Keimzahlen können schnell bestimmt werden (Messzyklus hier ebenfalls ca. 1 Stunde), aber die Teilchenzahl in KBE / 100 ml kann nicht detektiert werden. Immerhin erlaubt dieses Verfahren bereits eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten, nicht mehr vermehrungsfähigen Einzellern (die für eine Keimvermehrung nicht mehr relevant sind).

PCR-Methoden: keine Unterscheidung zwischen Lebend- und Tot-Zellen

Dies ist eine bekannte Schwäche der im Markt bekannten PCR-Methoden: obgleich ebenfalls rel. schnell und damit für ein online-Monitoring bedingt geeignet, werden hier DNA-Stränge aus lebenden wie aus bereits toten Zellen bzw. Zellkernen in rel. kurzer Zeit vermehrt und ermöglichen somit, in Verbindung mit Fluoreszenz-Markierungen, ebenfalls eine teilquantitative Keimzahlbestimmung. Darüber hinaus sind die PCR-Methoden eher laborgebundene Analysenmethoden mit einem rel. hohen apparativen Aufwand und damit verbundenen Investitionskosten, die in einem Produktionsbetrieb im rauen  Industriealltag kaum sicher betreibbar sind.

Real-Time-PCR mit Fluoreszenz-Detektion, Funktionsprinzip

Foto: Wikipedia / publ. domain, CC 3.0

Einen anderen, darüber hinausgehenden Weg wählen aktuell die Forscher der Berliner Wasserbetriebe. Da die Vielzahl vorkommender Keime und Mikroorganismen schwierig parallel online gemessen werden können, konzentrieren sie sich zunächst auf 3 „Leitkeime“, die als Indikatoren für eine Verkeimung von Trinkwasser angesehen werden können: E. coli, Enterococcus faecalis und Pseudomonas aeruginosa. In ihrem Verfahren namens Edit – „Entwicklung und Implementierung eines Anreicherungs- und Detektionssystems für das Inline-Monitoring von wasserbürtigen Pathogenen in Trink- und Rohwasser“, einem vom Bundesforschungsministerium geförderten Projekt, konzentrieren sie zunächst die möglichen vorkommenden Mikroorganismen über mehrere Filtrationsschritte auf – und markieren und eliminieren vor einer weiteren Untersuchung die DNA- bzw. RNA-Stränge von toten Zellen, bevor es mit speziellen molekularbiologischen Methoden weitergeht. Bisher gelingt es den Forschern auf diese Weise innerhalb von 5 Stunden ein zufriedenstellender quantitativer Nachweis der 3 Indikatorkeime – und zusätzlichen 3 weiteren Keimarten und 3 Virengattungen.

„Lab-on-a-chip“-Technologien: schnell, akkurat und flexibel

Abschließend noch eine spannende Entwicklung, die ebenfalls sehr vielversprechende Ergebnisse in Sachen Schnelligkeit und Präzision zeigt: sog. „lab-on-a-chip“-Technologien ermöglichen mit kleinsten Mengen (wenige Tropfen) bakteriell belastetem Wasser (gleich ob Trink-, Kühl- oder Abwasser) eine schnelle und sichere, allerdings wiederum nur qualitative Bestimmung mikrobieller Verkeimung.

Lab-on-a-Chip-Technologie, Beispiel

Foto: Wikipedia / publ. domain

So stellte die TU München vor geraumer Zeit mit dem Legio-Typer ein Messsystem vor, mit dem die gängigsten 19 Legionellen-Serotypen durch eine intelligente Antikörper-Kopplung parallel detektiert werden können. Das Konzept dieser Technologie ermöglicht es, nicht nur Legionellen-Species, sondern jede Art von Mikroorganismus im Wasser zu bestimmen – es muss nur der entsprechende Antikörper auf dem Chip platziert werden, um eine entsprechende Fluoreszenz-Detektion zu ermöglichen. Dabei ist das Verfahren nicht nur extrem schnell, sondern aufgrund der variablen Chip-Technologie auch sehr kostengünstig. Allerdings ist für das Analysengerät selbst noch eine erhebliche Investition zu tätigen – aber mit steigender Stückzahl werden hier sicherlich Kostensenkungen möglich sein.

Als Fazit ist festzustellen, dass aufgrund verstärkter gesetzlicher Auflagen und Prüfungen zunehmend Druck im Markt entsteht, neue Keimbestimmungsmethoden zu entwickeln. Im Grunde ein für Betreiber von Trinkwasserinstallationen wie auch von Kühlwasserkreisläufen positiver Trend: weiß man über möglichen Keimbefall bzw. eine unerwünschte Keimvermehrung Bescheid, kann man gezielt und fallbezogen eingreifen, spart Kosten für Biozide und andere Behandlungsmaßnahmen. Und auch die Umwelt profitiert, denn ein prophylaktischer Einsatz von umweltrelevanten und -schädlichen Chemikalien kann vermieden werden.

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Blog-Beiträge Dr. Matthias Brück

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